美國在體多光子顯微鏡研究

當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上，此時(shí)被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn)，這又導(dǎo)致返回的光束會聚或發(fā)散，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦，該技術(shù)可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學(xué)進(jìn)行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。美國在體多光子顯微鏡研究

以往我們認(rèn)識的光電效應(yīng)是單光子光電效應(yīng)，即一個(gè)電子在極短時(shí)間內(nèi)能吸收到一個(gè)光子而從金屬表面逸出。強(qiáng)激光的出現(xiàn)豐富了人們對于光電效應(yīng)的認(rèn)識，用強(qiáng)激光照射金屬，由于其光子密度極大，一個(gè)電子在短時(shí)間吸收多個(gè)光子成為可能，從而形成多光子電效應(yīng)，這已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為什么一般討論的光電效應(yīng)都是指單光子光電效應(yīng)呢？這是因?yàn)?，在使用普通光源的情況下，電子吸收兩個(gè)以上光子能量的概率是非常非常小的，幾乎為零。事實(shí)上，愛因斯坦本人就考慮過在強(qiáng)光下發(fā)生光電效應(yīng)的可能性問題。對此，他有如下的論述：光電效應(yīng)中的一個(gè)電子吸收兩個(gè)光子的幾率不會大于下雨天兩個(gè)雨滴同事打在一個(gè)螞蟻上的幾率。因此，多光子光電效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)上的研究成為可能，是二十世紀(jì)六十年代激光乃至強(qiáng)激光出現(xiàn)以后的事情。有了激光，對于雙光子光電效應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)上和理論上均取得了許多成果。利用強(qiáng)激光，人們不僅觀察到雙光子和三光子的光電效應(yīng)，甚至觀察到金靶材吸收幾十個(gè)等效光子實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。美國多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理多光子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢如何？又有哪些應(yīng)用？

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對焦時(shí)對反射鏡的機(jī)械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì)，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì)。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個(gè)臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個(gè)臂對齊，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描。

Ca2+是一種重要的第二信使，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理反應(yīng)中起著重要作用。發(fā)展和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)觀測Ca2+熒光信號，可以從某些方面分析生物體或細(xì)胞的變化機(jī)制，具有重要意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)，我們可以觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間熒光圖像的變化，也可以觀察到一定水平或部分細(xì)胞內(nèi)(Ca2+)的熒光圖像和變化。通過對單個(gè)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+的分布不僅在細(xì)胞的局部區(qū)域之間是不均勻的，而且在細(xì)胞內(nèi)不同深度或?qū)哟蔚木植繀^(qū)域之間也存在不同程度的Ca2+梯度，稱為空間Ca2+梯度。多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢。

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測，可以從某些方面對有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。美國靈長類多光子顯微鏡系統(tǒng)

從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。美國在體多光子顯微鏡研究

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時(shí)間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級），空間分辨率可達(dá)到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像。美國在體多光子顯微鏡研究