隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個問題,我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,進(jìn)而讓標(biāo)本“透明度”提高。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,是通過物鏡匯聚的。美國熒光雙光子顯微鏡成像原理
隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點(diǎn),大致可以分為兩個方面:深入和主動改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次,可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化,我們可以把激光束做得更細(xì),集中能量,讓激光穿透得更深。對于樣品,物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題,我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,從而提高標(biāo)本的“透明度”。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡大量運(yùn)營在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中;
雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系,還仍需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,通過研究人體基于多光子成像技術(shù),進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,篩選鑒定、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。討論環(huán)節(jié),來自病理科、呼吸中心、心臟科、神經(jīng)科、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論,其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計劃再次邀請王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。通過本次學(xué)術(shù)交流,病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達(dá)成了初步的合作意向。
新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,重只2.2克,適于佩戴在小動物頭部顱窗上,實(shí)時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號。在大型動物上,還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā),雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢,其橫向分辨率達(dá)到0.65μm,成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美,遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國腦科學(xué)計劃重要團(tuán)隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù),成像幀頻已達(dá)40Hz(256*256像素),同時具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外,采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖,該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針(如GCaMP6)的有效利用。同時采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號的接收,解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來,與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合,可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時,精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。
1990年初,當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時,他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時,Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實(shí)驗(yàn)搭建,采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。雙光子顯微鏡的原理是什么?進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡圖像對比度
雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢?美國熒光雙光子顯微鏡成像原理
微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,可用于在動物覓食、哺乳、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下,長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議上報告后,得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽(yù)。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議、美國明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的AlcinoJSilva教授在評述中寫道,“從任何一個標(biāo)準(zhǔn)來看,這款顯微鏡都了一項重大技術(shù)發(fā)明,必將改變我們在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式。它所開啟的大門,甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進(jìn)入一個新的時代,即通過對細(xì)胞群體中可辨識的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進(jìn)行成像觀測。美國熒光雙光子顯微鏡成像原理