細(xì)胞基因藥物領(lǐng)域的進(jìn)展使得對(duì)高質(zhì)量基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的需求急劇增加,包括高質(zhì)量慢病毒載體(LV)的大規(guī)模生產(chǎn)。宿主細(xì)胞DNA殘留(HCD)是一類(lèi)主要的工藝相關(guān)雜質(zhì),對(duì)下游純化帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。根據(jù)相關(guān)法規(guī)要求,需要去除HCD才能達(dá)到臨床級(jí)LV。HCD去除是通過(guò)核酸酶處理聯(lián)合下游工藝(DSP)共同實(shí)現(xiàn)的。文章作者研究了兩款核酸酶M-SAN HQ中鹽核酸酶(ArcticZymes Technologies)和Benzonase(Merck)對(duì)HCD去除效率的差別,其下游工藝包含過(guò)濾澄清及TFF超濾。相比傳統(tǒng)的全能核酸酶,M-SAN HQ中鹽核酸酶在生理鹽條件下,對(duì)HCD的去除效率更高。河北M-SAN中鹽核酸酶70950-160
核酸酶活性受到很多因素影響,如鹽濃度、pH、底物、溫度等。因此,不同客戶(hù)、不同項(xiàng)目中核酸酶的使用條件都不一。目前,生物制藥行業(yè)對(duì)Benonase全能核酸酶的使用比較熟悉,如生理鹽或低鹽濃度、脫鹽操作等。對(duì)于大部分使用Benzonase的項(xiàng)目,使用M-SAN HQ中鹽核酸酶可以完全替代,而且溫度、Mg2+濃度等條件不用做任何調(diào)整,同樣酶量的M-SAN HQ對(duì)宿主細(xì)胞DNA(HCD)的去除效果更好、病毒載體得率更高。經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化后,可以將M-SAN HQ中鹽核酸酶的用量減少到原來(lái)的1/3-1/2,且HCD去除效果及產(chǎn)品得率更高。河北中鹽核酸酶70950宿主細(xì)胞DNA主要以染色質(zhì)形態(tài)存在,其中組蛋白通過(guò)離子作用及疏水作用與DNA緊密結(jié)合;
慢病毒大規(guī)模純化的捕獲步驟包括:膜過(guò)濾澄清,隨后切向流過(guò)濾/超濾或者體積排阻色譜濃縮。此外,需用核酸酶(benzonase或M-SAN HQ中鹽核酸酶)來(lái)去除細(xì)胞殘留的、質(zhì)粒來(lái)源的DNA污染。這兩個(gè)步驟順序可以調(diào)整,依據(jù)項(xiàng)目工藝而定。兩種工藝路線各有優(yōu)缺點(diǎn):先用核酸酶消化的優(yōu)點(diǎn)是可去除大的DNA片段,且后續(xù)步驟可以去除殘留核酸酶;但所用的核酸酶的量也非常大。與此相反,將核酸酶步驟后置的優(yōu)點(diǎn)是大幅降低核酸酶的量(成本降低);但后面的步驟必須有將核酸酶去除的能力。此外,后期用核酸酶的缺點(diǎn)是核酸污染可能會(huì)結(jié)合慢病毒顆粒形成沉淀,進(jìn)而導(dǎo)致慢病毒在純化中流失,從而影響得率。
市售的M-SAN HQ中鹽核酸酶有三個(gè)規(guī)格,分別是25kU、500kU及5MU,分別滿(mǎn)足研發(fā)初期及大規(guī)模生產(chǎn)各階段的要求。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度在99%以上?;贏rcticZymes Technologies的30年的酶學(xué)開(kāi)發(fā)及大規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),M-SAN HQ的生產(chǎn)體系穩(wěn)定,產(chǎn)品純度高,批次一致性好,無(wú)蛋白酶活性。廠家開(kāi)發(fā)出特異的緩沖液體系,使M-SAN HQ保存起來(lái)更加穩(wěn)定,-15℃ - -30℃條件下保存4年沒(méi)有活性下降。研究數(shù)據(jù)表明,經(jīng)過(guò)5-6次的反復(fù)凍融,M-SAN HQ中鹽核酸酶活性沒(méi)有明顯變化。M-SAN HQ中鹽核酸酶在細(xì)胞培養(yǎng)條件或生理鹽濃度下具有較高活性。
ArcticZymes廠家對(duì)鹽活性核酸酶系列產(chǎn)品(Salt Active Nucleases,SANs)的生產(chǎn)及質(zhì)控,包括SAN HQ高鹽核酸酶和M-SAN HQ中鹽核酸酶,在符合ISO13485:2016體系基礎(chǔ)上,增加了cGMP質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),如microbes、endotoxin、蛋白酶等;同時(shí)提供TSE/BSE聲明、無(wú)動(dòng)物源(Animal-Origin Free)聲明、非轉(zhuǎn)基因聲明等文件協(xié)助藥物申報(bào)。此外,ArcticZymes的生產(chǎn)場(chǎng)地接受客戶(hù)的定期審計(jì),其第三方審計(jì)文件已得到國(guó)際TOP CDMO及Biotech的認(rèn)可,并已經(jīng)成為國(guó)際TOP CDMO的供應(yīng)商。具體文件體系可以跟廠家或?qū)?yīng)銷(xiāo)售人員聯(lián)系。M-SAN HQ中鹽核酸酶的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),都符合USP-EP要求。吉林M-SAN HQ中鹽核酸酶70950-202
M-SAN HQ中鹽核酸酶兼容常見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基,在多種培養(yǎng)基條件下去除核酸污染效率更高;河北M-SAN中鹽核酸酶70950-160
細(xì)胞基因藥物的基因遞送有病毒及非病毒兩種方式,其中病毒遞送更為常用。在病毒遞送路徑中,腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(Lentivirus)是常用的兩種載體;差別是病毒基因組的存在形式,AAV的基因組一般不整合到染色體中,以游離形式存在于染色體之外,且一般會(huì)表達(dá)數(shù)年之久;而慢病毒的基因組則會(huì)整合到染色體達(dá)到長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)的目的。此外,其它用于基因藥物的病毒載體有單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(Vaccina Virus)、痘病毒(Poxviruses)。河北M-SAN中鹽核酸酶70950-160