體外蛋白表達(dá)正在革新現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。以瘧疾診斷為例:將凍干的大腸桿菌裂解物、瘧原蟲 HRP2 基因 DNA 及顯色底物預(yù)裝在微流控芯片中,加入水樣后啟動(dòng) 30 分鐘體外蛋白表達(dá)反應(yīng),生成的 HRP2 蛋白催化顯色劑變紅,靈敏度達(dá) 5 寄生蟲/μL(傳統(tǒng)試紙只 200/μL)。此方案在剛果金野外測(cè)試中顯示,陽(yáng)性檢出率提升 40% 且無(wú)需冷鏈運(yùn)輸。類似技術(shù)已擴(kuò)展至COVID-19檢測(cè)——用患者鼻拭子 RNA 直接合成 Spike 蛋白,結(jié)合納米金抗體實(shí)現(xiàn) 1 小時(shí)確診。這種 “即測(cè)即表達(dá)”模式 將診斷成本降至 $0.5/次,成為資源匱乏地區(qū)的抗疫利器。大腸桿菌裂解物的??高翻譯效率??可支持??100μg/mL級(jí)??蛋白產(chǎn)量,限制造就完整功能的真**白表達(dá)。桿狀病毒蛋白表達(dá)包涵體
1、從DNA到106μg純化蛋白的時(shí)間不到48小時(shí)
2、Biacore檢測(cè)證實(shí)VEGF165與貝伐珠單抗結(jié)合具有功能活性,親和力達(dá)36pM通過eProteinDiscovery系統(tǒng)進(jìn)行快速無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)與純化篩選,次日即可進(jìn)行蛋白放大生產(chǎn),這一組合縮短了獲取高質(zhì)量蛋白以在Biacore系統(tǒng)上進(jìn)行功能驗(yàn)證的時(shí)間。
英國(guó)Nuclera公司由劍橋大學(xué)的博士生們于2013年創(chuàng)立。在撰寫論文期間,他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)難以獲取的問題是生物學(xué)領(lǐng)域的首要障礙和關(guān)鍵瓶頸。他們著手解決蛋白質(zhì)難以獲取的問題,以期改善人類健康狀況。公司的愿景是打造出從DNA到蛋白質(zhì)的原型設(shè)計(jì)系統(tǒng),以減少在藥物發(fā)現(xiàn)計(jì)劃中獲得靶蛋白的時(shí)間和障礙。上海曼博生物是Nuclera品牌的官方代理商。如咨詢產(chǎn)品信息,歡迎咨詢! 目的蛋白表達(dá)原理通過灌流式反應(yīng)器將CHO細(xì)胞體外蛋白表達(dá)??周期縮短至72小時(shí),單批次產(chǎn)量突破5g/L。
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如,在COVID-19期間,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)被用于數(shù)小時(shí)內(nèi)合成病毒抗原,加速疫苗候選物篩選。美國(guó)DARPA支持的“生物制造”項(xiàng)目利用凍干無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑,在戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體,實(shí)現(xiàn)便攜式、無(wú)需冷鏈的即時(shí)生物制造。這類場(chǎng)景凸顯了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在時(shí)效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可整合非天然氨基酸(通過修飾tRNA)、脂質(zhì)體(用于膜蛋白表達(dá))或翻譯后修飾酶(如糖基化酶)。
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)的興起可將這一時(shí)間縮短至十幾個(gè)小時(shí),但是仍需要現(xiàn)進(jìn)行表達(dá)載體的制備,體外擴(kuò)增和高通量蛋白表達(dá)然后再進(jìn)行篩選等多步操作。Nuclera將這些復(fù)雜的流程ji he到eProteinDiscovery系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用基于數(shù)字微流控的智能卡盒、蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)和無(wú)細(xì)胞蛋白合成,使研究人員更容易快速獲取高質(zhì)量蛋白質(zhì)。只要將目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列輸入配套軟件,就可以利用預(yù)設(shè)融合標(biāo)簽定制DNA構(gòu)建體以優(yōu)化表達(dá),然后將表達(dá)載體裝載到機(jī)器上,該系統(tǒng)就會(huì)通過自動(dòng)化構(gòu)建篩選(可同時(shí)篩24種DNA構(gòu)建體x8種無(wú)細(xì)胞混合物=192種獨(dú)特表達(dá)條件),根據(jù)可溶性、可純化性和純化產(chǎn)量數(shù)據(jù)確定Zui 佳表達(dá)條件,然后放大規(guī)模并獲取蛋白質(zhì)以供下游應(yīng)用,從DNA到可用于分析檢測(cè)的蛋白質(zhì)只需要48小時(shí)。系統(tǒng)已生產(chǎn)超過2,000種蛋白質(zhì),包含多種類型,其中約77%的人類蛋白。蛋白質(zhì)類型包括伴侶蛋白、水解酶、連接酶、氧化還原酶、信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)移酶等,分子量范圍為18kDa~300kDa(平均:46kDa)。獲得的難表達(dá)蛋白包括膜蛋白、含二硫鍵的蛋白和含高度無(wú)序結(jié)構(gòu)的蛋白等,還更容易地篩選和獲取同源物、直系同源物、突變和異構(gòu)體。體外蛋白表達(dá)技術(shù)使??致死性靶點(diǎn)研究成為可能??,為新藥開發(fā)提供關(guān)鍵依據(jù)。
在特殊應(yīng)用領(lǐng)域,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)CFPS的性價(jià)比難以用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)衡量。例如:① 非天然氨基酸標(biāo)記蛋白(如ADC藥物開發(fā)),細(xì)胞系統(tǒng)需基因改造且產(chǎn)量極低,而無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)CFPS直接添加修飾氨基酸即可實(shí)現(xiàn),單次反應(yīng)成本雖高但省去數(shù)月工程菌構(gòu)建時(shí)間;② 便攜式生物制造(如戰(zhàn)場(chǎng)急救蛋白生產(chǎn)),凍干無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)CFPS試劑可在無(wú)冷鏈條件下即時(shí)合成,其“按需生產(chǎn)”特性大幅降低倉(cāng)儲(chǔ)物流成本。這些場(chǎng)景下,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)CFPS的技術(shù)獨(dú)特性使其成為高性價(jià)比解決方案。大腸桿菌體外蛋白表達(dá)??的成本只為兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)的1/20,適合大規(guī)模篩選。目的蛋白表達(dá)原理
??兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物??(RRL)和??小麥胚芽裂解物??(WGE)是兩類常見真核平臺(tái),用于體外蛋白表達(dá).桿狀病毒蛋白表達(dá)包涵體
體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)的明顯缺陷在于 缺乏真核細(xì)胞器結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)鍵翻譯后修飾難以實(shí)現(xiàn):糖基化不完整性: 裂解物中缺乏高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,只能生成高甘露糖型等簡(jiǎn)單糖鏈,無(wú)法合成復(fù)雜雙觸角N-糖;磷酸化/乙?;Ш猓?激酶/磷酸酶網(wǎng)絡(luò)不完整,使信號(hào)通路蛋白的修飾狀態(tài)與生理?xiàng)l件差異明顯;二硫鍵錯(cuò)配風(fēng)險(xiǎn): 氧化還原環(huán)境調(diào)控不足導(dǎo)致多二硫鍵蛋白錯(cuò)誤折疊率升高。這些局限使體外蛋白表達(dá)在 zhi liao性抗體等需精確修飾的蛋白生產(chǎn)中應(yīng)用受限。桿狀病毒蛋白表達(dá)包涵體