大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2025-07-18

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)的雛形可追溯至20世紀(jì)50年代。1958年,Zamecnik頭次證明細(xì)胞裂解物中的翻譯機(jī)器可在體外合成蛋白質(zhì),為技術(shù)奠定基礎(chǔ)。1961年,Nirenberg和Matthaei利用大腸桿菌裂解物破譯遺傳密碼子,推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。然而,早期技術(shù)因表達(dá)量低、穩(wěn)定性差,長(zhǎng)期局限于實(shí)驗(yàn)室研究,主要用于密碼子解析和翻譯機(jī)制探索,未實(shí)現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用。近十年,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)技術(shù)加速向醫(yī)療、合成生物學(xué)等領(lǐng)域滲透。例如,在COVID-19期間,該技術(shù)被用于快速生產(chǎn)疫苗抗原和抗體。同時(shí),AI算法的引入實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)條件智能預(yù)測(cè),進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)效率。中國(guó)企業(yè)如蘇州珀羅汀生物通過(guò)自主研發(fā)試劑盒,推動(dòng)國(guó)產(chǎn)化替代。未來(lái),無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)或與代謝工程、微流控技術(shù)結(jié)合,成為生物制造和準(zhǔn)確醫(yī)療的he xin工具。不用養(yǎng)細(xì)胞,直接拿細(xì)胞內(nèi)部的“機(jī)器”(核糖體+酶)??在試管里進(jìn)行蛋白表達(dá)??。大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol

大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol,蛋白表達(dá)

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)是一種在體外(試管中)直接合成蛋白質(zhì)的技術(shù),利用細(xì)胞裂解物(如大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取物)中的核糖體、酶、tRNA等翻譯元件,無(wú)需活細(xì)胞即可快速生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。he xin特點(diǎn):高效快速:省去細(xì)胞培養(yǎng)步驟,幾小時(shí)內(nèi)完成表達(dá)(傳統(tǒng)方法需數(shù)天)。靈活可控:可自由添加非天然氨基酸、同位素標(biāo)記物或翻譯調(diào)控因子,定制特殊蛋白。兼容復(fù)雜蛋白:適合表達(dá)毒性蛋白、膜蛋白等傳統(tǒng)細(xì)胞系統(tǒng)難以生產(chǎn)的類(lèi)型。哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)陰性線性化質(zhì)粒經(jīng)酚氯純化后(濃度≥0.5 μg/μL),適用于 ??T7 啟動(dòng)子介導(dǎo)的體外蛋白表達(dá)??。

大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol,蛋白表達(dá)

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,體外蛋白表達(dá)技術(shù)主要服務(wù)于三大方向:診斷試劑開(kāi)發(fā): 通過(guò)凍干裂解物與靶標(biāo)基因預(yù)裝系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)傳染xing bing原體抗原的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)合成與檢測(cè);蛋白質(zhì)工程優(yōu)化: 構(gòu)建突變體文庫(kù)并并行表達(dá)篩選,快速獲得熱穩(wěn)定性/催化效率提升的酶變體;藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證: 表達(dá)跨膜受體等復(fù)雜蛋白,用于配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及抑制劑高通量篩選;合成生物學(xué)元件構(gòu)建: 作為人工合成細(xì)胞的he xin模塊,驅(qū)動(dòng)無(wú)細(xì)胞基因回路實(shí)現(xiàn)自我維持的蛋白表達(dá)。該技術(shù)明顯加速了從基因序列到功能蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)化周期。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如,在COVID-19期間,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)被用于數(shù)小時(shí)內(nèi)合成病毒抗原,加速疫苗候選物篩選。美國(guó)DARPA支持的“生物制造”項(xiàng)目利用凍干無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑,在戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體,實(shí)現(xiàn)便攜式、無(wú)需冷鏈的即時(shí)生物制造。這類(lèi)場(chǎng)景凸顯了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在時(shí)效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可整合非天然氨基酸(通過(guò)修飾tRNA)、脂質(zhì)體(用于膜蛋白表達(dá))或翻譯后修飾酶(如糖基化酶)。CHO細(xì)胞重組蛋白表達(dá)??是生產(chǎn)抗體的常用技術(shù)。

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體外蛋白表達(dá)技術(shù)的重點(diǎn)在于利用細(xì)胞裂解物中的生物合成機(jī)器(核糖體、tRNA、翻譯因子)在試管中直接合成蛋白質(zhì)。以大腸桿菌系統(tǒng)為例:首先制備含T7啟動(dòng)子的線性DNA模板,將其與商業(yè)化裂解物(如RocheRTS100)、能量混合物(ATP/GTP)及20種氨基酸混合,在37℃振蕩反應(yīng)2-4小時(shí)即可完成蛋白表達(dá)。整個(gè)過(guò)程無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染,速度比傳統(tǒng)方法快10倍以上。例如,COVID19刺突蛋白R(shí)BD結(jié)構(gòu)域的體外表達(dá)只需6小時(shí),而HEK293細(xì)胞系統(tǒng)需5天。該技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是開(kāi)放體系的可編程性——可直接添加非天然氨基酸(如Azidohomoalanine)合成定制化蛋白,為藥物偶聯(lián)物開(kāi)發(fā)提供高效平臺(tái)。添加納米盤(pán)磷脂的 ?GPCR體外蛋白表達(dá)??系統(tǒng),功能性受體得率提升至80%。定制蛋白表達(dá)的局限

合成生物學(xué)利用體外蛋白表達(dá)構(gòu)造??無(wú)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)??。大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol

近年來(lái),無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)市場(chǎng)呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì),主要受益于生物醫(yī)藥研發(fā)和合成生物學(xué)的需求激增。根據(jù)市場(chǎng)分析報(bào)告,全球CFPS市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)將在2025-2030年間以15%-20%的年均復(fù)合增長(zhǎng)率擴(kuò)張,其中北美和歐洲占據(jù)主導(dǎo)地位。多家生物技術(shù)公司(如ThermoFisher、Synthelis、ArborBiotechnologies)已推出商業(yè)化無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑盒和服務(wù),覆蓋從科研到工業(yè)級(jí)的生產(chǎn)需求。尤其在個(gè)性化醫(yī)療和快速疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)因其短周期、高靈活性成為企業(yè)布局的重點(diǎn),例如在mRNA疫苗生產(chǎn)中用于快速驗(yàn)證抗原設(shè)計(jì)。大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)protocol