無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)在毒性蛋白和膜蛋白的合成中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)細(xì)胞系統(tǒng)難以表達(dá)具有細(xì)胞毒性的蛋白(如溶菌酶、限制性內(nèi)切酶),而無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過(guò)體外開放環(huán)境規(guī)避了宿主細(xì)胞存活限制,可高效合成活性毒蛋白,例如珀羅汀生物成功表達(dá)的BamHI內(nèi)切酶,其Minimun活性濃度只需0.001μg/μL。此外,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過(guò)添加表面活性劑或脂質(zhì)體模擬膜環(huán)境,實(shí)現(xiàn)了全長(zhǎng)跨膜蛋白(如CLDN18.1)的可溶表達(dá),純度達(dá)80%以上,為藥物靶點(diǎn)開發(fā)提供了關(guān)鍵工具。線性化質(zhì)粒經(jīng)酚氯純化后(濃度≥0.5 μg/μL),適用于 ??T7 啟動(dòng)子介導(dǎo)的體外蛋白表達(dá)??。誘導(dǎo)型蛋白表達(dá)市場(chǎng)現(xiàn)狀
傳統(tǒng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)酶面臨周期長(zhǎng)(>72 小時(shí))且純化復(fù)雜的瓶頸。新一代連續(xù)流體外蛋白表達(dá)系統(tǒng) 通過(guò)耦合反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)高效合成:將大腸桿菌裂解物與纖維素酶基因模板泵入螺旋管,在 30℃ 恒溫條件下持續(xù)產(chǎn)出酶蛋白,每小時(shí)產(chǎn)量達(dá) 120 mg/L,較批次反應(yīng)提高 8 倍。德國(guó) BRAIN AG 公司利用此技術(shù)生產(chǎn) 耐熱木聚糖酶,直接添加至造紙漿料中降解半纖維素,使漂白劑用量減少 30%。該系統(tǒng)還支持 實(shí)時(shí)補(bǔ)料——補(bǔ)充消耗的氨基酸和能量物質(zhì)可維持 48 小時(shí)穩(wěn)定表達(dá),單位酶成本降至 $2.5/g,逼近發(fā)酵法經(jīng)濟(jì)閾值。大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)純化??scFv 抗體片段的體外蛋白表達(dá)??在4小時(shí)內(nèi)完成,較傳統(tǒng)CHO 細(xì)胞系統(tǒng)提速 10 倍。
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)的he xin組分包括細(xì)胞裂解物(如大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞或小麥胚芽提取物),其中含有核糖體、tRNA、氨酰-tRNA合成酶及轉(zhuǎn)錄/翻譯因子(如啟動(dòng)/延伸/終止因子)。此外,系統(tǒng)需補(bǔ)充能量再生系統(tǒng)(如ATP、磷酸肌酸與肌酸激酶)以維持反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行,以及底物(氨基酸、核苷酸)和輔因子(Mg2?、K?等)以支持蛋白質(zhì)合成。例如,大腸桿菌S30提取物常通過(guò)敲除核酸酶和蛋白酶來(lái)提升蛋白穩(wěn)定性。英國(guó)nuclera高通量微流控蛋白表達(dá)篩選系統(tǒng)可支持助力無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù),如想更多關(guān)于該產(chǎn)品的信息,歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物!
在小規(guī)模、快速驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)的性價(jià)比優(yōu)勢(shì)明顯。其單次反應(yīng)成本約200-500元(含商業(yè)化裂解物和模板),雖高于大腸桿菌發(fā)酵的試劑成本,但可節(jié)省大量時(shí)間——傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)需3-5天(含轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)),而CFPS只需4-8小時(shí)即可獲得ug-mg級(jí)蛋白,尤其適合藥物篩選、突變體庫(kù)構(gòu)建等時(shí)效性需求。例如,某CRO公司采用CFPS一周內(nèi)完成50種抗體變體的活性測(cè)試,而傳統(tǒng)方法只能完成5-10種,人力與設(shè)備成本大幅降低。芯片級(jí)體外蛋白表達(dá)??體現(xiàn)較前沿的進(jìn)展。
體外蛋白表達(dá)技術(shù)的重點(diǎn)在于利用細(xì)胞裂解物中的生物合成機(jī)器(核糖體、tRNA、翻譯因子)在試管中直接合成蛋白質(zhì)。以大腸桿菌系統(tǒng)為例:首先制備含T7啟動(dòng)子的線性DNA模板,將其與商業(yè)化裂解物(如RocheRTS100)、能量混合物(ATP/GTP)及20種氨基酸混合,在37℃振蕩反應(yīng)2-4小時(shí)即可完成蛋白表達(dá)。整個(gè)過(guò)程無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染,速度比傳統(tǒng)方法快10倍以上。例如,COVID19刺突蛋白R(shí)BD結(jié)構(gòu)域的體外表達(dá)只需6小時(shí),而HEK293細(xì)胞系統(tǒng)需5天。該技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是開放體系的可編程性——可直接添加非天然氨基酸(如Azidohomoalanine)合成定制化蛋白,為藥物偶聯(lián)物開發(fā)提供高效平臺(tái)。添加 0.1% Triton X-100 使疏水蛋白的體外表達(dá)可溶率達(dá)90%??。大腸桿菌可溶蛋白表達(dá)包涵體
大腸桿菌裂解物的??高翻譯效率??可支持??100μg/mL級(jí)??蛋白產(chǎn)量,限制造就完整功能的真核蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)型蛋白表達(dá)市場(chǎng)現(xiàn)狀
在中國(guó),無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)的推廣面臨he xin原料依賴進(jìn)口的挑戰(zhàn)。商業(yè)化裂解物、高效能量再生系統(tǒng)等關(guān)鍵試劑仍以Thermo Fisher、Merck等國(guó)際品牌為主,國(guó)產(chǎn)替代品在活性和穩(wěn)定性上存在差距,導(dǎo)致成本居高不下。此外,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)工藝的規(guī)?;糯蠹夹g(shù)尚未成熟,反應(yīng)體系均一性、產(chǎn)物收率等問(wèn)題限制了其在GMP生產(chǎn)中的應(yīng)用。盡管國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)(如中科院、清華大學(xué))在基礎(chǔ)研究上取得突破,但產(chǎn)學(xué)研轉(zhuǎn)化效率較低,缺乏類似Synthelis的專注無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的本土企業(yè),難以形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈條。誘導(dǎo)型蛋白表達(dá)市場(chǎng)現(xiàn)狀