焦磷酸測序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標(biāo)準(zhǔn)。焦磷酸測序作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進(jìn)行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。在序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN公司在焦磷酸測序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢，目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMarkQ24的強(qiáng)項在于可對多達(dá)24個樣品進(jìn)行焦磷酸測序。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMarkQ96ID上進(jìn)行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量**化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMarkQ96MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進(jìn)行準(zhǔn)確測序。這些不同平臺的推出，對于我們實際研究提供了更有效的檢測手段。 全基因組甲基化分析及特異位點甲基化檢測。遼寧單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)
DNA羥甲基化(5hmC)是被認(rèn)為是哺乳動物基因組上的第六堿基。Bisulfite-Seq并不能區(qū)分甲基化(5mC)和羥甲基化(5hmC)，實際上是5mC和5hmC兩種修飾的混合信號，而通過氧化亞硫酸鹽測序(oxidativebisulfitesequencing,oxBS-Seq)，先將5hmC氧化為甲?；揎?5fC)，進(jìn)而被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換為堿基U，實現(xiàn)DNA甲基化的精細(xì)檢測。而同時對樣本進(jìn)行BS-Seq和oxBS-Seq測序則可實現(xiàn)對5hmC全基因組，單堿基分辨率的檢測，是羥甲基化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方案。(12):1730-1741.(IF=)作者利用全基因組氧化-亞硫酸鹽測序(WGBS/oxWGBS)得到了肝臟和肺以及配對**組織的全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜。在活躍的基因中，5hmC在CpGIslandshore中呈***富集狀態(tài)，而在CpGIsland中則呈稀缺狀態(tài)。對啟動子、基因體和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的羥甲基化分析，羥甲基化與基因表達(dá)有很強(qiáng)的正相關(guān)，這表明5hmC是活躍基因的標(biāo)記，并且可以在由DNA去甲基化調(diào)節(jié)的基因表達(dá)中發(fā)揮作用。 江蘇MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)RRBS用于人、哺乳動物及魚類方向的高水平甲基化研究。
甲基化特異性PCR（MS-PCR）
DNA在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG若無甲基化，則序列中的C改變?yōu)閁，若有甲基化則保持不變，因此從理論上講，用不同的引物做PCR，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變，就可以相應(yīng)設(shè)計M和U引物，有時我們需要設(shè)計兩輪引物。
這種方法靈敏度高，無需特殊儀器，因此經(jīng)濟(jì)實用，是目前應(yīng)用**為***的檢測方法。不過也存在一定的局限性，預(yù)先需要知道待測片段的DNA序列，引物的設(shè)計非常重要。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)
通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異，因此DNA樣本經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn)。使用該方法進(jìn)行甲基化分析*需一對引物，相對簡單，不過這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，并且在進(jìn)行實時定量PCR過程中，需要使用飽和的熒光染料。利用MS-HRM技術(shù)進(jìn)行甲基化檢測只能對檢測片段整體甲基化情況進(jìn)行分析，并不能明確每個CpG位點的甲基化狀態(tài)。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測，篩選出感興趣的CPG位點，然后利用其他方法進(jìn)行單個位點的精確檢測及甲基化程度的精確定量。 芯片數(shù)據(jù)如何與二代、三代數(shù)據(jù)整合。
羥甲基化DNA免疫沉淀測序（HydroxymethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing，hMeDIP-Seq）是通過5hmC特異性抗體富集羥甲基化的DN**段，然后結(jié)合高通量測序技術(shù)在全基因組水平上以較小的數(shù)據(jù)量，快速、高效地尋找羥甲基化區(qū)域?？蓮V泛應(yīng)用于羥甲基化與疾病關(guān)系研究以及羥甲基化在胚胎發(fā)育過程中的研究。技術(shù)優(yōu)勢從項目背景了解、協(xié)助方案設(shè)計、實驗材料選取、建庫測序，到數(shù)據(jù)分析每個項目有特定的科學(xué)問題；需要專業(yè)、有價值的建議；科學(xué)、縝密的設(shè)計及時高效的溝通；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=3ug；樣品濃度>50ng/ul；無RNA和蛋白污染建庫測序：測序策略：IlluminaHiSeq,PE150;測序深度：20-30Mreads信息分析基于全基因組范圍的羥甲基化分析，數(shù)據(jù)質(zhì)控，Peak鋒Calling，Peak鋒在基因組、染色體、功能元件上的分布，多樣本羥甲基化差異聚類，差異羥甲基化DMR鑒定及相關(guān)基因的功能分析，結(jié)合項目背景和科學(xué)問題的數(shù)據(jù)亮點挖掘。 云生物提供DNA甲基化和羥甲基化的表觀實驗和信息分析技術(shù)服務(wù)。浙江h(huán)MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)活動
提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果。遼寧單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)
微生物定植對腸道免疫和代謝相關(guān)基因DNA甲基化的影響——團(tuán)隊成員發(fā)表
Early microbial colonization
affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism
in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19. (IF= 5.415)
我們以早產(chǎn)幼豬為模型，采用RRBS測序，比較正常(CON,
n=7) 和口服*** (AB, n=7)早產(chǎn)豬的腸道DNA甲基化差異，發(fā)現(xiàn)***減少了細(xì)菌密度及多樣性，同時改變了DNA甲基化水平。其中與先天免疫應(yīng)答、吞噬、內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)和組織代謝等相關(guān)基因的DNA甲基化和表達(dá)存在***的差異。這種有賴腸道菌群的表觀遺傳修飾參與調(diào)控腸道免疫及營養(yǎng)代謝等，可能對早產(chǎn)兒的短期和長期的腸道健康至關(guān)重要。 遼寧單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)