美國在體多光子顯微鏡方案

世界多光子激光掃描顯微鏡產業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據著世界多光子激光掃描顯微鏡市場64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α鴥蕊@微鏡制造市場目前斷層嚴重。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術沉淀，20年以上經營積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造、光學重要部件設計及工藝嚴重制約產業(yè)升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康、奧林巴斯等國外企業(yè)。國內具備生產顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國內顯微鏡企業(yè)能打破技術壁壘，切入顯微鏡市場，企業(yè)的生產經營將騰躍至一個更高的格局。多光子顯微鏡銷售/營銷策略建議。美國在體多光子顯微鏡方案

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。嚙齒類多光子顯微鏡數(shù)據分析多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態(tài)、生理學研究。

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展和科學技術的進步，特別是后基因組時代的到來，人們已經能夠根據需要建立各種細胞模型，這為在體內研究基因表達、分子間相互作用、細胞增殖、細胞信號轉導、誘導分化、細胞凋亡和新生血管生成提供了良好的生物學條件。然而，盡管利用現(xiàn)有的分子生物學方法對基因表達與蛋白質的相互作用進行了深入細致的研究，但仍然無法實現(xiàn)對蛋白質和基因活性的實時動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因尤其是蛋白質的表達、修飾和相互作用往往是可逆的、動態(tài)變化的。目前，分子生物學方法無法捕捉到蛋白質和基因的這些變化，但獲得這些信息對于研究基因表達與蛋白質的相互作用非常重要。因此，有必要發(fā)展一種動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質和基因活性的方法。

針對雙光子熒光顯微鏡的特點，從理論上分析雙光子成像特點，并搭建一套時間、空間分辨率高，能實時、動態(tài)、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應實現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進行探測;（2）用特定染料對樣品標記以后，能實現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實驗的研究，改進雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質量的前提下，簡化整個系統(tǒng)，使得實驗操作方便、安全。單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內轉換把部分能量轉移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學光學成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢。而在顯微成像中，雙光子熒光顯微鏡憑其獨有的優(yōu)點，成為研究細胞結構和功能檢測的重要工具。多光子顯微鏡技術是對完整組織進行深層熒光成像的優(yōu)先技術。

多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā)，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產生多光子吸收。熒光強度正比于（激光強度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對細胞毒性和光漂白更小。多光子顯微鏡將生物打印結構準確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內制造復雜結構。美國bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻、開發(fā)、進步和數(shù)個世紀以來多個來源和地點的改進。美國在體多光子顯微鏡方案

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。美國在體多光子顯微鏡方案