江蘇熒光顯微鈣成像inscopix

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整在體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光?？梢詫?duì)深部腦區(qū)、皮層區(qū)域等大部分腦區(qū)進(jìn)行鈣成像使用鈣離子指示蛋白。江蘇熒光顯微鈣成像inscopix

包含鈣離子指示劑的細(xì)胞可以通過熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)觀測(cè)，然后通過CCD攝像機(jī)捕捉、記錄圖像?，F(xiàn)在鈣成像技術(shù)主要在以下幾類神經(jīng)科學(xué)研究方面有廣泛應(yīng)用：1.記錄培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動(dòng)。2.記錄腦片上神經(jīng)元的活動(dòng)。記錄神經(jīng)元的活動(dòng)。由于離體實(shí)驗(yàn)本身的限制，現(xiàn)在越來越多的神經(jīng)方面科學(xué)家傾向于做在體鈣成像實(shí)驗(yàn)，希望能得到更準(zhǔn)確且更能反應(yīng)生理狀況的數(shù)據(jù)。得益于雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展，現(xiàn)在在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于huoti狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進(jìn)展。4.記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘（spine）的活動(dòng)。由于對(duì)于實(shí)驗(yàn)精度的要求，有些科學(xué)家不僅只想記錄單個(gè)神經(jīng)元的反應(yīng)，他們還想更確切地知道神經(jīng)元上哪些樹突和樹突棘參與了某個(gè)行為，也就是說他們需要在huoti條件下，對(duì)單根樹突以及某些spine進(jìn)行鈣成像記錄實(shí)驗(yàn)。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發(fā)展，現(xiàn)在，對(duì)樹突和樹突棘用鈣成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)行記錄也成為了可能。上海特殊鈣成像供應(yīng)商鈣成像技術(shù)能直接測(cè)量神經(jīng)元和神經(jīng)元組織中動(dòng)態(tài)的鈣流動(dòng)。

傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行在體成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對(duì)海馬樹突棘的鈣離子信號(hào)進(jìn)行成像，研究神經(jīng)元突觸后長(zhǎng)時(shí)程yizhi；觀察小鼠運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位等等。不過，這些實(shí)驗(yàn)還是需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的動(dòng)物進(jìn)行研究。

單光子顯微技術(shù)是較成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較短，成像深度有限；能量較大,會(huì)造成對(duì)熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對(duì)樣本損害大,很難用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像。而寬場(chǎng)顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但寬場(chǎng)顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測(cè)。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個(gè)樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹突棘中的鈣分布。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行活動(dòng)動(dòng)物成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。

鈣成像技術(shù)（calciumimaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測(cè)組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面，在在體（invivo）或者離體（invitro）實(shí)驗(yàn)中，鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于同時(shí)監(jiān)測(cè)成百上千個(gè)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而檢測(cè)神經(jīng)元的活動(dòng)情況）。有了鈣成像技術(shù)，原本悄無聲息的神經(jīng)活動(dòng)就變成了一幅斑斕閃爍的壯觀影像，科學(xué)家終于可以親眼看著神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中往來穿梭。因此，這種技術(shù)一出現(xiàn)，就受到了全世界神經(jīng)科學(xué)家們的追捧，至今依然是人們觀測(cè)神經(jīng)活動(dòng)直接的手段。鈣信號(hào)在大腦皮層中更能反映神經(jīng)元的活性,因此神經(jīng)元鈣信號(hào)的檢測(cè)對(duì)研究大腦皮層功能至關(guān)重要。上海動(dòng)物神經(jīng)元鈣成像nVista3.0

對(duì)于鈣離子成像來說，大多數(shù)情況下速度很重要。江蘇熒光顯微鈣成像inscopix

對(duì)于雙光子（2P）鈣成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)大的深度限制因素，而對(duì)于三光子成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性三光子顯微鏡比結(jié)構(gòu)性三光子顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布guangfan的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)江蘇熒光顯微鈣成像inscopix