誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)品。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcell,iPS)自身具有致瘤性風(fēng)險(xiǎn),在體內(nèi)可形成畸胎瘤,整合病毒載體的使用和誘導(dǎo)多能性可能增加iPS細(xì)胞插入致突變性和致性的風(fēng)險(xiǎn)。因此,應(yīng)在shou次臨床試驗(yàn)前完成致瘤性試驗(yàn)。若設(shè)計(jì)科學(xué)合理,能夠滿足評(píng)價(jià)要求,也可在持續(xù)時(shí)間足夠長(zhǎng)的毒性研究中評(píng)估致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)致瘤性試驗(yàn)建議采用摻入未分化iPS細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)品作為陽(yáng)性對(duì)照,以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的靈敏度。如果iPS細(xì)胞設(shè)計(jì)了機(jī)制以降低致瘤風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)在體內(nèi)試驗(yàn)中確認(rèn)/驗(yàn)證此類機(jī)制的功能 高深度全基因組重測(cè)序服務(wù),該方法能多方位精細(xì)地對(duì)基因編輯的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行off-target檢測(cè)。南京種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估
gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配: 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下,18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針:1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配;2) 在PAM的12 bp內(nèi),應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾:在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾,使脫靶切割減少40-120倍,同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性,降低脫靶效應(yīng)。深圳高精度脫靶檢測(cè)分析脫靶檢測(cè)在揭示CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶機(jī)制以及進(jìn)一步提高系統(tǒng)靶向性的研究中具有重要作用。
R-loop seq雖然不是一種真正意義上的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法,但能為堿基編輯脫氨酶的脫靶提供一種度量方法,以便于之后的脫氨酶點(diǎn)突變優(yōu)化,來(lái)降低脫靶的發(fā)生幾率。2) Detect-seqCRISPR衍生技術(shù)由于其復(fù)雜性,檢測(cè)其脫靶位點(diǎn)的hexin思路是捕獲實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。這種設(shè)計(jì)思路下,目前較為成功的是檢測(cè)堿基編輯CBE脫靶位點(diǎn)的Detect-seq[13]。CBE的原理是將dC脫氨變?yōu)閐U,迫使其對(duì)側(cè)的dG變?yōu)閐A,較終將堿基對(duì)從C-G轉(zhuǎn)變?yōu)門-A。Detect-seq便是針對(duì)中間態(tài)的dU,使用Uracil DNA Glycosylase (UDG),去除U堿基后,替換為帶Biotin的U堿基,捕獲堿基編輯的脫靶位點(diǎn),并且sgRNA依賴和sgRNA不依賴的脫靶位點(diǎn)都能找到。該方法類似檢測(cè)DNA甲基化的重亞硫酸鹽測(cè)序法,通過(guò)處理特定的堿基,可以捕獲全基因組上的CBE脫靶位點(diǎn)。
堿基編輯器:CBE:胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor,CBE),依賴于胞嘧啶核苷脫氨基酶,通過(guò)將胞嘧啶核苷脫氨轉(zhuǎn)換為尿嘧啶核苷,尿嘧啶核苷在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶核苷,從而實(shí)現(xiàn)C到T的轉(zhuǎn)換。已開發(fā)出四代CBE(BE1、BE2、BE3和BE4),由于BE3引起的脫靶效應(yīng)相對(duì)較少,因此它已在動(dòng)物(小鼠)、細(xì)菌和植物細(xì)胞中廣用于編輯細(xì)胞的基因組成。腺嘌呤堿基編輯器(Adenine base editor,ABE),依賴于腺嘌呤核苷脫氨基酶,通過(guò)將腺嘌呤核苷脫氨轉(zhuǎn)換為次黃苷,然后在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為鳥嘌呤核苷,從而實(shí)現(xiàn)腺嘌呤(A)到鳥嘌呤(G)的轉(zhuǎn)換。新開發(fā)的堿基編輯器ABE8e,比ABE7.10增加了590倍的靶向活性。針對(duì)已經(jīng)獲得的有切割能力的sgRNA,需要進(jìn)一步明確其體內(nèi)脫靶效應(yīng)。
目前鼓潤(rùn)已掌握了該項(xiàng)技術(shù),簡(jiǎn)述如下:1、CRISPR與dsODNtag整合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及高通量測(cè)序建庫(kù)流程將靶向于目標(biāo)基因組位點(diǎn)的CRISPR質(zhì)粒與dsODNtag以核電轉(zhuǎn)的方式同時(shí)轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞,CRISPR造成基因組雙鏈斷裂后,dsODNtag將整合入斷點(diǎn)處,作為后續(xù)分析在靶與脫靶情況的標(biāo)記。轉(zhuǎn)染后3天收集細(xì)胞的DNA進(jìn)行高通量建庫(kù)。2、GUIDE-seq生信分析方法1)搭建了高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)分析流程。2)利用該技術(shù)分析了CRISPR靶向編輯某細(xì)胞系基因的在靶與脫靶情況。其中一例樣品的分析結(jié)果如圖4所示:Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-seq.Theintendedtargetsequenceisshowninthetoplinewithcleavedsitesshownunderneathandwithmismatchestotheon-targetsiteshownandhighlightedincolor.GUIDE-seqsequencingreadcountsareshowntotherightofeachsite.3)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合Sanger測(cè)序鑒定了分析出的脫靶位點(diǎn)。脫靶檢測(cè)政策,推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測(cè)效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。無(wú)錫基因編輯脫靶檢測(cè)報(bào)告
脫靶(off-target)效應(yīng)是指MicroRNA Agomir/Antagomir可以與特異性互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合。南京種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估
采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品。對(duì)于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品,應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評(píng)估,以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對(duì)靶基因序列的特異性。在評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)時(shí),應(yīng)說(shuō)明所選擇的評(píng)價(jià)策略的合理性和敏感性。雖然采用計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)基因編輯的潛在脫靶位點(diǎn),并對(duì)潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行深度測(cè)序分析,可用于評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn);但選擇的評(píng)價(jià)策略仍應(yīng)包含體外全基因組測(cè)序比對(duì),以證明潛在脫靶位點(diǎn)未出現(xiàn)脫靶。此外,在評(píng)估脫靶活性時(shí),還應(yīng)評(píng)估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類型的差異對(duì)非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)性的影響。必要時(shí),還應(yīng)分析基因編輯對(duì)細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。南京種子基因脫靶檢測(cè)評(píng)估